|
Az OGR Állattechnológiai egység szerkezete
 Az MTA-KOKI Orvosi Géntechnológiai Részlegben az állatok tartása három különbözõ higiéniai szinten történik.
A legmagasabb szintû állattartás és a genetikailag módosított egerek szaporítása SPF körülmények között történik. Az itt tartott állatok részére steril tápot, almot és ketrecet biztosítunk, a csapvizet ultraszûrjük. A 12-szeres klimatizált légycserét HEPA filteren szûrve biztosítjuk. A 12 órás fényciklust automata kapcsolók biztosítják.
A bejárás korlátozott, a személyzet tisztálkodás után steril overallban tartózkodik a térben.
Azon anyagok, amelyek nem autoklávozhatóak, kémiai fertõtlenítés után kerülhetnek be a steril térbe.Állatot csak meghatározott állatbeszállítóktól engedünk be, a bekerült állatok karantén helységbe, alacsony nyomáson tartott szellõztetett szekrénybe kerülnek, ahonnan csak a megerõsített státuszigazolás után kerülhetnek ki.
Minden más állat vonal csak rederiválással kerülhet be az SPF állattartó térbe
A Medical Disease (MD) szinten helyezkednek el a kutatói szobák és mûtõk. Erre a szintre is csak SPF igazolással érkezett állatokat engedünk be, de a kutatók bejárása egyszerûbb és az anyagforgalom sincs elõzetes sterilizációhoz kötve. Ezen a szinten került kialakításra a Magatartás vizsgáló laboratóriumok, valamint egy perfundáló helyiség.Az OGR Befogadó állomása a magasabb állattartó szintektõl távolabb került kialakításra, teljesen elkülönült klíma egységgel. Ez a szint konvencionális állattartást tesz lehetõvé. A veszélyes ágenssel fertõzött genetikailag módosított vonalak tartása klíma elszívó ágára kötött szellõztetett szekrényekben történik a vonal kórokozómentesítéséig.
REDERIVÁLÁS
Az SPF higiéniai státusz elérése rederivációval (R) történik, mellyel fertõzött anyától fertõzésmentes utódot nyerünk. Régebben az elterjedt módszer a császármetszés volt, azonban az általunk is használt embrió-átültetéses eljárás biztonságosabb. A rederiválandó nõstényt hormonnal kezeljük (5 NE ecg) amivel többszörös tüszõérést serkentünk, majd a második napon a tüszõk repedését indukáljuk (5 NE hcg) és a donor hímekkel pároztatjuk. A párosodás tényét a következõ nap délelõtt a hüvelyben a cowper-mirigy váladék jelenlétével ellenõrizzük (plug képzõdés).
Az embrió gyûjtése már az egysejtes stádiumtól lehetséges (a párosodástól számított fél nap). Az ilyen stádiumú embrió a petevezetõ ampullájában, petecsomóba ágyazva található, melyet kibontás után hyase enzimmel tehetünk szabaddá. Az idõsebb (3,5 napos korú), blasztociszta fejlõdésben levõ embriók a méh közvetlen átmosásával nyerhetõk ki. A rederiváció fontos lépése az embriók tripszines kezelése, mellyel az embriót borító tok, a zona pellucida (ZP) felületrõl leoldjuk az esetleg odatapadt kórokozókat. A sterilizáló fürdetés után az embriók a steril térbe kerülnek, ahol a donorral azonos ivari ciklusban levõ, SPF higiéniai státuszú álvemhes recipiensbe ültetjük. A beültetés altatással, mûtéti úton történik.
 A beültetett állat a karanténba kerül, ahol szellõztetett ketrecben az utódok választásáig tartjuk. A rederiválás eredményességét a recipiens anya választás utáni higiéniai státuszvizsgálatával ellenõrizzük.
A rederiválást homo- (genetikailag módosított (GM) hím és nõstény pároztatása) vagy heterozigóta (GM hím és vadalany nõstény pároztatása) állapotú tenyészpárokkal végezzük. A homozigóta rederiváláskor az utódok izogén állapotban születnek, azonban több vonal rossz szaporodási mutatókkal bír és embriótermelésük is gyenge. A heterozigóta rederiváláskor ezen hátrány kiküszöbölhetõ, azonban a homozigóta állapot csak hosszabb ideig tartó tenyésztéssel érhetõ el. A rederiválás után minden állatot genotipizálunk, ami már nem a szolgáltatás része.
GENOTIPIZÁLÁS
 Olyan esetekben, ahol a genotípus a fenotípusból, illetve egyszerû vizuális módszerrel, mint a zöld fluoreszcens fehérje in vivo kimutatása nem lehetséges, a genotípust molekuláris biológiai módszerekkel a genomiális DNS-bõl határozzuk meg. A genomiális DNS-t farokbiopsziából preparáljuk. A mintavétel optimális ideje a 12-14 napos kor, amikor a farokban a még kedvezõ a DNS és extracelluláris mátrix arány, de elég nagyok a kölykök az egyedi jelöléshez. A fenolos extrakcióval kinyert genomiális DNS-t TE pufferben 1 évig õrizzük. A genotípust PCR eljárással határozzuk meg. Minden reakciót lehetõség szerint különbözõ primerpárokkal kétszer végzünk el, és a genotípust a validált eredmény alapján határozzuk meg.
KOLÓNIA ALAPÍTÁS
A korlátozott számban beszerezhetõ (egy-egy hím vagy nõstény) törzsek elszaporításának alaplépcsõje a kolóniaalapítás. A vonal tulajdonosa szerint egyeztetve a kívánt vad alannyal heterozigóta tenyészpárokat alakítunk ki, majd további tenyésztéssel homo- vagy heterozigóta kolóniát alapítunk. A kolónia 2-3 fertilis szülõpár, melyet szellõztetett ketrecben tartunk. A kolónia alapítás szolgáltatást tenyészpáronként számítjuk.
KOLÓNIA FENNTARTÁS
A genetikailag módosított vonalak kísérletre való felhasználása a gyakorlat szerint nem folyamatos, az állatokra hosszabb-rövidebb ideig nincs szükség. Hely és költségtakarékossági szempontból csak néhány szülõpár tenyésztése kívánatos. A kolónia fenntartás során génmódosított vonaltól függõen hetero- vagy homozigóta állapotú tenyészetet állítunk be, ahol a nõstényeket 6-8 ellésig, a hímeket egy évig tartjuk tenyésztésben. A kolóniákat szükség szerint frissítjük, hogy mindig rendelkezésre álljon 2-3 fertilis szülõpár a kolónia felszaporítására. A heterozigóta kolóniák esetében a fenntartáshoz genotipizálás is szükséges, ami nem része a szolgáltatásnak.
EMBRIÓ MÉLYHÛTÉS (EH)
 A mélyhûtött embriók tárolásával az állattörzsek szinte korlátlan ideig megõrizhetõk folyékony nitrogénben tárolva, mínusz 197 °C-os hõmérsékleten. Elõnyei közül kiemelhetõ:
- olyan GM vonalak megõrzése, melyeket kísérletben idõlegesen nem kívánnak fenntartani, de a vonal megõrzése indokolt (embrióbank).
- rederiváláshoz az embriók gyûjtése olyan esetben, amikor recipiens állat nem áll rendelkezésre.
- az állatok nemzetközi kereskedelme egyszerûbb, mint élõállat formájában.
Az EH munkafázisai közül a szuperovuláltatás, embrió kinyerése, sterilizáló fürdetése megegyezik azzal, ami a korábbi fejezetben ismertetésre került. A mélyhûtés során az embriót ún. krioprotektív médiumokkal kezeljük, amelyekkel a sejteket megvédjük a hûtés során keletkezõ makro-kristályok károsító hatásától. Az általunk egérembrióra adaptált módszer a Vajta Gábor által kidolgozott OPS vitrifikációs módszer. Embrióbank céljára 250-300 embriót mélyhûtünk le, két, egymástól független tárolóedényben raktározva. A mélyhûtés hatékonyságát teszt beültetéssel ellenõrizzük.
EMBRIÓ FELOLVASZTÁS
A mélyhûtött embrió felolvasztása során a krioprotektív anyagokat a blasztomérákból embriós médiumokban való fürdetéssel ki kell vonni. A procedúra során egy sterilizáló tripszines fürdetést is beiktatunk.
EMBRIÓ BEÜLTETÉS
Az embriót friss vagy mélyhûtöttbõl felolvasztott állapotban, az embrió korához szinkronizált recipiensbe ültetjük be. Befogadó állatnak B6CBA F1 törzset használunk mivel a vonal anatómiai sajátsága folytán az embrió-beültetés kockázata csekély, az anyák jó utódnevelõk és kannibalizmus is csak ritkán tapasztalható.
|
